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Der Chemiker Mike Heilemann will Prozesse in menschlichen Zellen besser verstehen, um die biomedizinische Forschung voranzu\u00adbringen. Dabei arbeitet er mit superaufl\u00f6sender Mikroskopie, die das Unsichtbare sichtbar macht.<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n
Im Jahr 1873 beschrieb der Jenaer Physiker Ernst Abbe folgendes Ph\u00e4nomen: Liegen zwei Strukturen enger beieinander als etwa die halbe Wellenl\u00e4nge des zur Beobachtung eingesetzten Lichts, sind sie im Mikroskop nicht mehr r\u00e4umlich voneinander getrennt abbildbar. Diese optische Aufl\u00f6sung liegt f\u00fcr sichtbares Licht im Bereich von 200 bis 300 Nanometern und sorgt daf\u00fcr, dass n\u00e4her zusammenliegende Strukturen zu einem einzigen Fleck verschwimmen. Das ist f\u00fcr die Zellbiologie schlecht, weil es eng zugeht in menschlichen Zellen. Ein f\u00fcnf Nanometer kleines Protein zum Beispiel trennen von seinen Nachbarproteinen viel weniger als diese 200 Nanometer. Dicht gepackte Proteine in Zellen sind also mit herk\u00f6mmlichen Technologien optisch nicht aufzul\u00f6sen. Zum Gl\u00fcck aber l\u00e4sst sich die Abbe\u2019sche Beugungs- oder Aufl\u00f6sungsgrenze heute umgehen, mit trickreichen lichtmikroskopischen Verfahren, die unter dem Begriff superaufl\u00f6sende Mikroskopie zusammengefasst sind. Mike Heilemann vom Institut f\u00fcr Physikalische und Theoretische Chemie forscht genau in diesem Bereich. Er macht Schritt f\u00fcr Schritt immer mehr winzige Objekte und sogar r\u00e4umliche Anordnungen im Nanokosmos Zelle sichtbar.<\/p>\n\n\n\n
Um zu demonstrieren, wozu superaufl\u00f6sende Mikroskopie f\u00e4hig ist, stellt der Chemiker in seinem B\u00fcro auf dem Computerbildschirm zwei Aufnahmen nebeneinander. Zu sehen ist jeweils das Strukturprotein Mikrotubulin, das in den Zellen so etwas wie Transportschienen bildet (Filamente), auf denen Stoffe von einem Ort zum anderen gelangen. F\u00fcr die mikroskopischen Aufnahmen wurden die Filamente mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, der im Laserlicht blau leuchtet. Das erste Bild zeigt die Grenzen klassischer Technologie auf. Alles erscheint reichlich verschwommen. Die Filamente, bl\u00e4ulich schimmernde F\u00e4den, wirken so sehr aufgebl\u00e4ht, dass sie teils nicht auseinanderzuhalten sind. \u00bbHier sehen wir die Beugung am Werk\u00ab, erkl\u00e4rt Heilemann. \u00bbWenn Lichtwellen auf ein Hindernis treffen, \u00e4ndern sie ihre Ausbreitungsrichtung. Das f\u00fchrt dazu, dass ein bis zwei Nanometer gro\u00dfe Fluoreszenzfarbstoffe als viel gr\u00f6\u00dferes kreisf\u00f6rmiges Lichtmuster erscheinen, in einer Gr\u00f6\u00dfe von 200 Nanometern. Genauso gro\u00df werden die d\u00fcnnsten Tubulin-Filamente dargestellt, die eigentlich nur 25 Nanometer Durchmesser haben.\u00ab Anders schaut es beim zweitem Bild aus, das mit superaufl\u00f6sender Mikroskopie ange\u00adfertigt wurde. Hier gibt es keinen \u00bbAufbl\u00e4heffekt\u00ab der Lichtsonden: Die Filamente erscheinen relativ scharf gestellt und k\u00f6nnen, weil sie d\u00fcnn sind, im Bild voneinander getrennt wahrgenommen werden. So wird die r\u00e4umliche Struktur sichtbar, das Wirrwarr der einzelnen, schl\u00e4ngelnd \u00fcber- und untereinander laufenden F\u00e4den.<\/p>\n\n\n\n
Viele Aufnahmen hintereinander<\/h4>\n\n\n\n
Eine wichtige Technologie der superaufl\u00f6senden Mikroskopie ist die Einzelmolek\u00fcl-Lokalisierungsmikroskopie (single molecule localization microscopy, SMLM), ein spezielles fluorenszenzmikroskopisches Verfahren. Im Kern werden bei der Fluoreszenzmikroskopie Farbstoffmolek\u00fcle verwandt, die von Licht angeregt selbst Licht mit ver\u00e4nderter Wellenl\u00e4nge abgeben (Fluo\u00adreszenz). Man h\u00e4ngt den Farbstoff an ein Biomolek\u00fcl und steuert beide zusammen, als Fluoreszenzsonde, in Richtung Zielmolek\u00fcl in der Zelle, wo die Sonde andockt. Wird sie durch Laserlicht bestimmter Wellenl\u00e4ngen angestrahlt, schie\u00dft sie Lichtblitze ab, und so wird das Zielmolek\u00fcl, etwa ein Protein, im Mikroskop sichtbar. Der Trick bei SMLM: Die Sonden geben die Lichtblitze nicht gleichzeitig ab, sondern hintereinander. Ein Zielmolek\u00fcl nach dem anderen leuchtet auf. \u00bbDiese zeitliche Trennung erlaubt es, Bilder zu rekonstruieren, die eine nahezu molekulare Aufl\u00f6sung von wenigen Nanometern haben\u00ab, so Heilemann.<\/p>\n\n\n\n
Einzelmolek\u00fcl-Lokalisierungsmikroskopie hat jedoch einen gro\u00dfen Nachteil: Sie ist langsam. Heilemann erl\u00e4utert: \u00bbNehmen wir an, unser Zielprotein in einer einzelnen Zelle tritt in 100\u2009000 Kopien auf. Um dieses abzubilden, m\u00fcssen wir insgesamt 100\u2009000 einzelne Punkte optisch voneinander trennen. Pro Bildaufnahme k\u00f6nnen nur wenige Molek\u00fcle gleichzeitig detektiert werden, sonst kommt es zu \u00dcberlappungen.\u00ab Die Aufnahme w\u00fcrde dann nur etwas undefinierbar Wolkenartiges zeigen und nicht die molekulare Struktur. Nur wenige Molek\u00fcle pro Bildaufnahme bedeuten aber, dass bei 100\u2009000 Punkten viele einzelne Auf\u00adnahmen n\u00f6tig sind \u2013 eine zeitraubende Angelegenheit.<\/p>\n\n\n\n
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K\u00fcnstliche Intelligenz hilft<\/h4>\n\n\n\n
Heilemann ist es jedoch gelungen, das Verfahren erheblich zu beschleunigen. Als Grund\u00adtechnik setzt er einen SMLM-Ableger ein, das PAINT-Verfahren. Hier docken die Fluoreszenzsonden nur ganz kurz ans \u00adZielmolek\u00fcl an, geben ihr Lichtsignal ab und schwimmen dann wieder weg. Tempomacher sind neuronale Netzwerke (Deep Learning), die als \u00bbdigitale Erweiterung\u00ab ans Mikroskop gebaut wurden. Diese K\u00fcnst\u00adliche Intelligenz l\u00e4sst sich so trainieren, dass sie Molek\u00fcle erkennt und deren Position bestimmt, selbst wenn der Abstand zwischen den Molek\u00fclen viel kleiner ist als die Aufl\u00f6sungsgrenze. \u00bbSo k\u00f6nnen wir eine viel gr\u00f6\u00dfere Anzahl an Molek\u00fclen pro Bildaufnahme verarbeiten\u00ab, erkl\u00e4rt Heilemann. Die Bildgebung wird 10 bis 20 Mal so schnell, und es sind nur noch wenige einzelne Aufnahmen f\u00fcr die komplette Struktur notwendig.<\/p>\n\n\n\n Noch viel wichtiger als die Zeitersparnis ist f\u00fcr Heilemann und sein Team aber der wissenschaftliche Erkenntnisgewinn, den die neuro\u00adnalen Netze bringen. Denn erst durch die Tempo\u00aderh\u00f6hung lassen sich Dynamiken visualisieren, die Bewegungen und Ver\u00e4nderungen in der lebenden Zelle. Dies veranschaulicht ein hochaufgel\u00f6stes Video einer lebenden Zelle, das Heilemann auf seinem Rechner zeigt: Zu sehen ist ein Organell im Zytoplasma, das Endoplasmatische Reticulum. Es besteht aus Membranen, die viele R\u00f6hren und Taschen bilden. Im Video sind die R\u00f6hren als d\u00fcnne, wei\u00dfe Linien zu erkennen und pausenlos in Bewegung. Sie trennen sich voneinander und verbinden sich neu. In jeder Sekunde ver\u00e4ndert das Gebilde seine Form. So sieht es aus, wenn sich die R\u00f6hren des Organells reorganisieren. Im Leben einer Zelle l\u00e4uft dieser Prozess permanent ab. Er h\u00e4ngt mit den Aufgaben des Endoplasmatischen Reticulums zusammen, das f\u00fcr Teilschritte der Proteinsynthese, aber auch f\u00fcr den Proteinabbau verantwortlich ist. \u00bbVieles, was da passiert, verstehen wir noch nicht, da wir mit der Bildgebung erst seit Kurzem in diese Dimension vorgedrungen sind. Derzeit schaffen wir 30 bis 40 Nanometer Aufl\u00f6sung \u2013 ein sehr guter Wert f\u00fcr die Strukturbildgebung in lebenden Zellen. Entscheidend ist dabei, dass wir erneuerbare Fluoreszenzsonden verwenden, sodass wir diese Dynamik f\u00fcr eine lange Zeit in lebenden Zellen beobachten k\u00f6nnen.\u00ab<\/p>\n\n\n\n Bei Heilemanns Arbeit geht es neben dem Einfangen der Dynamik auch darum, zellul\u00e4re Objekte innerhalb einer Aufnahme unterscheiden zu k\u00f6nnen \u2013 und daf\u00fcr braucht es Farben, m\u00f6glichst viele Farben. Heilemann: \u00bbIn jeder Zelle gibt es Tausende verschiedener Proteine mit unterschiedlichen Funktionen. Es reicht nicht, ein oder zwei davon zu betrachten, denn wir wollen die \u203amolekulare Soziologie\u2039 verstehen, das Zusammenspiel der einzelnen Proteine und Proteinkomplexe. Diese sind, wie wir \u00adMenschen, letztlich nur das Resultat ihrer Umgebung. Und diese Umgebung m\u00fcssen wir als Ganzes abbilden, um die strukturelle Organisation der Zelle zu entschl\u00fcsseln.\u00ab<\/p>\n\n\n\n Hierzu setzen der Forscher und sein Team auch wieder das PAINT-Verfahren ein, welches Zielmolek\u00fcl und Lichtsonde ja nur f\u00fcr eine kurze Zeit zusammenbringt \u2013 anders als in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie, wo Lichtsonde und Zielmolek\u00fcl fest miteinander verkn\u00fcpft sind. Als Sonden dienen kurze DNA-Str\u00e4nge. Weil diese PAINT-typisch nur kurz binden und dann wieder wegdiffundieren, \u00adblockieren sie das Zielmolek\u00fcl nicht. Auf diese Weise lassen sich viele Proteine nacheinander in der gleichen Zelle visualisieren, das Verfahren nennt sich Multiplexing. \u00bbDadurch k\u00f6nnen wir nacheinander eine gr\u00f6\u00dfere Zahl an Proteinen visualisieren als bei herk\u00f6mmlicher Fluoreszenzmikroskopie.\u00ab Die Proteine werden dann nach der eigentlichen Visualisierung noch mit Farben versehen \u2013 jeder Proteintyp bekommt dabei einen eigenen Anstrich.<\/p>\n\n\n\n Eine Multiplexing-Aufnahme zeigt es: Zu sehen sind vor schwarzem Hintergrund viele kleine Punkte in den Farben Gr\u00fcn, Gelb, Rot und Blau. Wie ein bunter Nachthimmel voll blinkender Sterne. Die \u00bbSterne\u00ab sind in diesem Fall spezielle Proteine in der Zellmembran, die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren (fibro\u00adblast growth factor receptors, FGFR). Von denen gibt es vier verschiedene. Die roten Punkte sind FGFR1, die gelben FGFR2, die gr\u00fcnen FGFR3 und die roten FGFR4. Man sieht, dass sich manche Proteine in r\u00e4umlicher N\u00e4he befinden. Es gibt ein rot-blaues Proteingespann, genauso ein rot-gr\u00fcnes und ein blau-gelbes. Auch solche Interaktionen sind mit Multiplexing visualisierbar. Und wenn mal komplexere Strukturen mit mehr als vier unterschiedlichen Proteintypen sichtbar gemacht werden sollen? Kein Problem, so Heilemann: \u00bbWir k\u00f6nnen diese Technik erweitern und noch viel mehr Proteine darstellen.\u00ab<\/p>\n\n\n\n Als N\u00e4chstes versuchen Heilemann und sein Team, versteckte Informationen mithilfe physikalischer \u00bbTricks\u00ab aus den Aufnahmen herauszufiltern. Denn ihnen ist etwas aufgefallen: Eine Fluoreszenzsonde an einem Zielmolek\u00fcl gibt nicht nur einen Lichtblitz ab. Es sind meist drei, vier oder sogar f\u00fcnf Signale. \u00bbDie Frequenz verr\u00e4t uns die Anzahl der Molek\u00fcle an dieser Position. Das hei\u00dft, wir werden da Objekte finden, die wir r\u00e4umlich selbst mit hochaufl\u00f6sender Mikroskopie gar nicht aufl\u00f6sen k\u00f6nnen.\u00ab Ein weiterer wichtiger Schritt: die Untersuchung von molekularen Prozessen auf der Nanoskala in sowohl gesunden als auch kranken Zellen. Was in einer gesunden Zelle passiert, ist ja etwas anders als der Prozess in einer kranken. Die Unterschiede sollen herausgearbeitet werden. Zudem ist geplant, die Wirkung von Substanzen auf diese Prozesse zu analysieren. Die Grund\u00adlagenforschung werde mithilfe superaufl\u00f6sender Mikroskopie gro\u00dfe Fortschritte machen, hofft Heilemann. Das Verst\u00e4ndnis der genauen Zusammensetzung von Proteinkomplexen und deren Dynamik stelle in Zukunft eine wichtige Basis f\u00fcr die Entwicklung ziel\u00adgenauer Wirkstoffe gegen Krankheiten dar.<\/p>\n\n\n\n Zur Person<\/strong><\/p>\n\n\n\n Mike Heilemann hat in Konstanz, Heidelberg und Montpellier von 1996 bis 2001 Chemie studiert und von 2002 bis 2005 im Fach Physik in Heidelberg und Bielefeld seine Promotion an\u00adgefertigt. Es folgten Forschungsaufenthalte in Oxford, Bielefeld und W\u00fcrzburg. Seit 2012 ist er Professor am Institut f\u00fcr Physikalische und Theoretische Chemie. Er ist Mitglied der Bunsengesellschaft f\u00fcr Physikalische Chemie, der European Light Microscopy Initiative, der Biophysical Society, der European Photo\u00adphysical Association und der Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Heilemann ist Principal Investigator der Clusterinitiative SCALE (https:\/\/scale-frankfurt.org) der Goethe-Universit\u00e4t. Der Forschungsverbund entwickelt neuartige Technologien, um die inneren Strukturen von Zellen abzubilden und ihr Verhalten vorherzusagen.<\/p>\n\n\n\n heileman@chemie.uni-frankfurt.de<\/a><\/p>\n<\/div>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n![\"\"](\"https:\/\/aktuelles.uni-frankfurt.de\/wp-content\/uploads\/2024\/02\/gewebe_web-500x500.jpg\")
Unterschiedliche Farben kommen nachher dazu<\/h4>\n\n\n\n
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Die Lichtblitze z\u00e4hlen<\/h4>\n\n\n\n
![\"\"](\"https:\/\/aktuelles.uni-frankfurt.de\/wp-content\/uploads\/2024\/02\/Heilemann_Mike_c_privat_web.jpg\")
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